Influência Da Adição De Ácido Ascórbico Na Maturação E Cultivo In Vitro De Embriões Bovinos

Norton Klein, Roney Dos Santos Ramos, Sandra Elisa Pozzobon, Maiara Aline Gonçalves, Daniela Dos Santos Brum

Resumo


Introdução: No trato reprodutivo da fêmea, os oócitos e embriões encontram-se envoltos pelos fluidos folicular e tubárico, ricos em antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, que os protegem contra o estresse oxidativo proveniente da alta concentração de oxigênio e formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). O ácido ascórbico, importante antioxidante não enzimático e hidrofílico, capaz de neutralizar as ROS, pode ser encontrado na combinação destes fluidos. O estresse oxidativo tem sido enfatizado como um dos principais fatores responsáveis pela menor taxa de produção e baixa qualidade na produção in vitro (PIV), podendo induzir a apoptose, retardo e ou bloqueio do desenvolvimento dos embriões, estas alterações tornam-se evidenciadas a partir da contagem de células embrionárias. Assim, fica clara necessidade desenvolvimento de um sistema in vitro com poder antioxidante para neutralizar as ROS e seus efeitos prejudiciais. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de ácido ascórbico na (PIV) de embriões bovinos, durante os processos de maturação e cultivo in vitro, sobre o total de células embrionárias no dia 9 de cultivo (D9). Material e Métodos: Os complexos cumulus-oócitos obtidos de ovários de frigorífico foram distribuídos aleatoriamente em grupos e maturados em TCM-199 adicionado de FSH, LH e 10% de soro de vaca em estro (SVE), por 22 a 24h, em estufa a 39ºC e 5% CO2 em ar e umidade saturada. A fecundação in vitro foi conduzida com um milhão de espermatozóides/ml em TALP-Fert com heparina e PHE, por 18 a 22h, nas mesmas condições da MIV. Os prováveis zigotos foram cultivados in vitro em meio SOFaaci com 5% de SVE sob óleo mineral em estufa a 5% CO2 em ar e umidade saturada até o dia 9 (D9). Durante a PIV utilizou-se 100 µM (T1), 250 µM (T2) ou 500 µM (T3) de ácido ascórbico no meio de maturação (MIV) ou cultivo in vitro (CIV). Os resultados foram comparados ao grupo controle, sem adição de antioxidantes e submetidos à análise estatística pelo teste do Qui-quadrado com significância de 5%. Posteriormente a PIV, os embriões em estágio de blastocisto expandido em D9, foram fixados em paraformol a 2% e mantidos refrigerados até a contagem das células embrionárias. Para a contagem das células, os embriões foram lavados em meio TCM-HEPES e, então, corados com Hoechst (33342) e visualizados em microscópio de imunofluorescência equipado com filtros de excitação (365 nm) e emissão (410 nm), para visualização dos núcleos das células embrionárias. Resultados e Discussão: A média do número de células dos blastocistos produzidos com a adição de ácido ascórbico na MIV foi semelhante entre o grupo controle (83,21), T1 (80,86) e T3 (85,34), enquanto os embriões do T2 apresentaram um menor número de células (70,5:P

Palavras-chave


Estresse oxidativo, Ros, Antioxidante, Células embrionárias, Miv/civ

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