DESENHO RACIONAL IN SILICO E SÍNTESE ARTIFICIAL DE UM VETOR PARA EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS

Jéssica Silva Tapia, Paulo Marcos Pinto, Luiz Fernando Duarte da Silva, Thalita Fonseca de Araujo, Gabriel da Luz Wallau, Juliano Tomazzoni Boldo

Resumo


A expressão de proteína heteróloga é uma ferramenta biotecnológica importante, e tem sido extensivamente utilizada para a obtenção de proteínas específicas em quantidade suficiente para estudos de sua estrutura e função ou para aplicações clínicas e/ou industriais. O hospedeiro mais comum para produção de proteína heteróloga é a bactéria Escherichia coli, devido suas inúmeras vantagens, dentre elas seu rápido crescimento, seu cultivo de baixo custo, a capacidade de introdução do DNA exógeno usando um método de transformação simples além de possibilitar a produção de proteínas heterólogas em grande quantidade. No entanto expressar essas proteínas apresenta algumas dificuldades. As etapas principais para a produção de uma proteína recombinante compreendem a escolha do gene de interesse, a escolha do sistema de expressão, clonagem e expressão. Os plasmídeos de expressão bacterianos contêm, basicamente, um promotor forte e regulado e um sítio de múltipla clonagem, além de origem de replicação procariótica e do marcador genético. Os principais plasmídeos de expressão utilizam os promotores Lac, Tac e T7. O promotor Lac é semelhante ao utilizado pelas cepas tipo selvagem de E. coli, e é reprimido pela proteína lacI na ausência de indutor e induzido em sua presença. O promotor Tac contém a região operadora do Operon Trp e a região promotora do Operon Lac. Assim, ambos promotores são induzidos por lactose ou IPTG e utilizam a RNA polimerase bacteriana para transcrever o gene de interesse. O promotor T7, utiliza a RNA polimerase do fago T7, tendo como vantagem a RNA polimerase mais ativa do que a bacteriana, e nível de expressão proteica bem maior. Deve se ter em mente que o propósito será obter a proteína traduzida corretamente. Para tanto, é necessário respeitar o sinal de transcrição e tradução de genes procarióticos, além da fase de leitura e a ausência de íntrons no caso de regiões codantes de genes eucarióticos. Neste processo são necessárias clonagens subsequentes que acabam por aumentar o custo e tempo dos experimentos. Assim, o trabalho objetiva desenvolver um vetor de expressão que não necessita subclonagens, utilizando apenas um evento de clonagem e de transformação da bactéria de expressão. O constructo para expressão foi desenhado racionalmente in silico a partir de um promotor Lac responsivo a IPTG, seguido por um sinal de exportação celular (peptídeo-sinal), um fragmento strep-tag para purificação e um sítio para trombina, permitindo a clivagem da proteína de interesse dos tags fusionados. Foram inseridos dois sítios para endonucleases de restrição (BamHI e XbaI) que permitem a clivagem do gene clonado no constructo. Este que foi sintetizado artificialmente. Como perspectiva, serão realizados testes de expressão qualitativa e quantitativa com a clonagem da região codante sem íntrons do gene humano FJL7355 e determinação da função da proteína produzida e purificada.

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